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de novo基因组测序及分析
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de novo基因组测序及分析
 
de novo测序(也叫从头测序),是指不用任何参考序列而对某个物种进行测序,用生物信息学方法进行组装,最终获得该物种的基因组序列图谱。
目前,全基因组测序已逐步成为各个物种基础研究的重要手段之一。通过基于新一代高通量测序技术的全基因组测序,可以预测重要基因和蛋白以了解其功能和可能机制。在研究病原菌的致病性与疾病的预防和治疗方面,可以鉴定致病相关基因、开发和研究疫苗、开发新型抗生素等;在研究细菌进化方面,可以研究种内进化关系;合理利用有益真菌,对控制和预防有害真菌对人类的生产和生活具有重要意义。在大型动植物领域,更是对该物种的进化研究,基因改良育种有重大的作用。
 
一、技术路线
                     de novo测序技术路线图
 
二、技术指标
 
基因组框架图
基因组精细图
基因组覆盖率
>90%
>95%
基因区覆盖率
>95%
>98%
Contig N50
>5 Kb
>20 Kb
Scaffold N50
>20 Kb
>300 Kb
单碱基错误率
<0.01%
<0.01%
本指标具体根据所分析的物种可能会有变化,请与当地销售代表联系
 
三、 生物信息分析
可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析服务内容。
 
四、 相关案例
图a为装配基因测序深度的分布;b为装配基因与BAC序列的对比
 
a为对齐与不对齐的非重复序列的长度;图b为将人、熊猫和狗的染色体同线的位于同一条染色体上
 
五、 常见问题
1. 第二代测序技术与传统Sanger测序相比有什么优势?
答:第二代测序技术的测序通量是传统Sanger法的上万倍,并且可以进行长片段双末端测序,将测序数据拼接成较长的Contig和Scaffold。与Scaffold法相比,具有高通量、高灵敏度、高准确性、低成本和耗时短等多个突出优势。如人类基因组测序是六个国家耗资27亿多美元历经10年才完成的,而如今利用第二代测序技术平台,只需几个月就可以完成。
2. 测序的实验周期是多久?
答:根据具体基因组大小和复杂程度来确定完成时间,一般地从获得样品到高通量测序完成,细菌等小基因组需要1-2个月,其他基因组需要2-6个月。
3. DNA样品的送样要求如何?
答:DNA样品总量不小于10µg,浓度≥200ng/µL,OD值在1.8-2.0之间,样品浓度越高越好。请填写完整的送样订单,用自封袋密封后随同样品一起附干冰送样。
4. 是否需要生物学重复?重复几次?
答:是的,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。把这篇文章列在参考文献里吧
5. 如何检测基因组组装的准确性?
答:目前,主要可以通过以下几种方法来检验基因组组装的准确性。(1) 通过构建BAC或Fosmid文库,并进行常规测序,将所得序列与拼接好的Contigs作比对以判断基因组组装的准确率。(2)将已知的基因序列与拼接好的Scaffold作比对,查看两者是否吻合,吻合度越高,表明基因组组装越好。而且已知的基因序列越多,评价结果越可靠。(3)估计组装后基因组的单碱基准确度,利用新一代测序技术,如果95%以上的基因组单碱基覆盖度超过20×,则认为该见机组的单碱基准确度较高。
6.    如何避免基因组中的重复序列造成的组装错误?
答:应用新一代高通量测序技术,构建200bp、500 bp、2 Kb、6 Kb、10 Kb、20 Kb等不同大小的DNA测序文库,进行双末端海量测序,可以避免基因组中的重复序列造成的错拼。当测序数据量达到基因组大小的60倍以上时,即可保证基因组的完整性和序列中单碱基的准确性。
 
六、 相关文献
1. Li R, Fan W, Tian G, Zhu H, et al The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature 2010 Jan 21; 463:311-17. Epub 2009 Dec 13

2. Genome Sequence of Staphylococcus capitis QN1, Which Causes Infective Endocarditis. J. Bacteriol. 2012, 194(16):4469. DOI: 10.1128/JB.00827-12.

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