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数字PCR技术服务
双击自动滚屏 发布者:shdobio 发布时间: 阅读:

数字PCR技术服务

数字 PCR 的特征
 
1. 稀有变异检测(Rare variant detection
从外周血内获得分子生物标记物、进行特异突变筛查、监测病程是医疗保健的一个发展
方向。这要求检测体系(探针和引物)必须保证能在高背景野生型等位基因存在的条件下检测
到低丰度的突变基因。由于数字PCR 降低了对反应扩增效率的要求,采取终点法判读的方
法,数字PCR 可以很好的胜任稀有变异检测的工作,同时也减少了引物设计过程中由于扩
增效率不合要求而造成的浪费(时间、样品、耗材等等)。
 
2. 拷贝数变异(Copy-number variation
虽然生殖系或体细胞拷贝数变化是否具有临床意义需要取决于具体临床情况,但 CNV
改变基因表达水平却有十分重要的临床意义。数字PCR 具有准确性和精确性的特点,这使得其可以在CNV 研究中发挥重要的作用。在有已知拷贝数的内参基因的前提下,数字PCR
不但可以清晰区分一个或者两个拷贝,更可以对多拷贝基因进行分析,例如,五个或者六个
拷贝。在这一点上,相比于包括qPCR 在内的常规方法,数字PCR 优势明显。
 
3 样本需求量低(Minimal template requirements
数字 PCR 的一个主要优势是所需样本量很低,这对于一些临床样本来说特别重要,尤
其是样本珍贵或者样本核酸存在降解的情况下。目前很多基因组研究方法,例如CGH 芯片、
二代测序等,在实验之前都需要对有限的临床样本进行扩增以保证达到实验样本量的要求。
然而,实际情况是,预扩增会引入偏向(bias),无法保证不改变样本内待测基因的相对丰
度,对实验结果影响的严重程度取决于不同的应用。
数字 PCR 样本需求量低的特性可以避免由于预扩增所引入的实验误差,更好的实现实
验的精准性和可靠性。
 
4 分析便捷(Ease of Analysis
数字 PCR 有或无的结果判读非常简洁。对于相对定量分析来说,只需使用泊松原理将
阴性/阳性微滴的比例转换成表达丰度、使用一个或多个内参基因进行均一化后即可完成分
析。
 
5 与二代测序整合(Integration with next generation sequencing protocols
如何在临床领域发挥 NGS 的巨大优势是一个重要的问题。数字PCR 是一项非常有用
的互补型技术。例如:使用数字PCR 检测患者特异性标记物,与肿瘤配对末端测序实验结
果进行相互验证,并且可以进行NGS 文库的制备和定量。
目前很难确认什么样的 NGS 结果是临床所需要的,通常来说NGS 筛选到的变异或异常还需要使用经典的Sanger 测序进行验证。数字PCR 的出现,可以为NGS 发现的突变进
行有效验证提供一个非常好的实验思路与平台。
 
1. 突变/稀有变异检测(Mutation/rare variant detection
随着伊马替尼(imatinib)在bcr-abl 阳性的慢性粒细胞白血病上的成功应用,越来越多
的科学家将研究重点转移至生物标记物的开发及基于特异基因的靶向治疗。数字PCR 已经
成功的应用于肿瘤组织内的EGFR 检测以及EGFR 突变频率的分析。
是否能够开发出有效的靶向治疗药物,与突变基因的检测密切相关。其中(1)携带药
物作用突变位点的癌细胞百分比;(2)突变的特定等位基因是否可以被准确检测到,这两
点都直接影响到靶向治疗是否有效。很显然,在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单,但
是如果在异质组织内,在仅存有少量突变存在的情况下,如何准确检测出突变/稀有变异,
或者针对于同一种癌症中多种亚克隆的准确鉴定,对个性化医疗的发展是一个巨大的挑战。
最近的一项研究表明,数字PCR 在进行突变/稀有变异检测中发挥着重要的作用。使用
NGS 对于肝癌的一个抑癌基因进行筛查,30 倍覆盖全基因组筛查并没有检测到该基因,但
76 倍覆盖的成对外显子筛查却可以检测到。后续使用传统毛细管测序进行验证,结果也不
能确认。然而使用数字PCR 可以轻松的检测到该突变,而且精准的确认该突变的突变频率
为13.2%。因此,对于突变等位基因的研究来说,研究平台的灵敏度和准确性是未来的研
究开发焦点所在。
数字 PCR 的另外一个潜在的重要应用是通过检测患者外周血样对进入外周循环的的肿
瘤组织核酸进行分析。数字PCR 技术可以直接忽略预扩增的环节直接进行准确的定量分析,
相比于传统的PCR 检测方法,有更高的灵敏度。而且更令人鼓舞的是,有实验证据证明,
微滴式数字PCR 可以实现1:100,000 的突变频率筛查。
同样的,在无创产前筛查领域,也已经有研究证明可以通过数字PCR 的方法可以对游
离在孕妇外周血内的胎儿DNA 进行准确分析,用来检测婴儿的21 号染色体三体。这表明,
在未来数字PCR 可能会取代NGS 实现临床21 三体的无创筛查。
在转化移植领域,数字 PCR 也发挥着重要的作用,有数据证明,数字PCR 可以在心
脏移植受体患者外周血内检测到供体特异DNA。这对移植后排异反应的跟踪和预估提供了
很好的科研证据。
总的来说,数字 PCR 虽然不能发现新的生物标志物,但却是对于临床样本生物标志物
定量分析的不二之选。
 
2. 药理学(Pharmacogenetics
有研究表明,不但体细胞变异会影响治疗药物的选择,生殖细胞特定基因的变异对特定
处方的选择也会有直接的影响。有一些点突变或者SNP 位点可能会影响药物代谢;还有一
些情况下一些特异位点的CNV 可以预测药物对个体的疗效。在未来,通过数字PCR 技术,
我们可以获得更多关于生殖细胞CNV 对药理学影响的实验证据。
 
3. 基因表达分析(Gene expression analysis
除了常规的基因表达分析以外,数字 PCR 特别适用于单细胞或少量细胞的基因表达谱
分析,这是对临床生物标志物筛选和鉴定的很好探索。最近,有一些科学家开始着眼于非编
码RNA(non-coding RNA, ncRNA),尤其是其中的亚类-microRNAs。从原理上来讲,使
用数字PCR 进行microRNA 的分析更为可行,同时,在ncRNA 的筛选和鉴定领域,数字
PCR 也可以与NGS 互为补充,互为印证,推动这一领域的发展。
 
数字PCR 与二代测序(NGS)/全基因组测序的关系
在过去的三年内,二代测序技术飞速发展,NGS 的巨大数据信息和并行样本处理能力
可以用来进行CNV 的预测。数字PCR 是一个很好的平台,可以与NGS 平台获得的数据进
行相互印证。数字PCR 平台可以进行精准的绝对定量分析,极佳的数据重现性,而且样本
需求极低。而且,数字PCR 的平台可以很好的整合真个实验流程,实现目标测序、个体生
物标志物开发、化疗后外周血检测的完整研究路线。
 
总之,数字PCR 是一个全新的绝对定量方式,整合了目前成熟发展的数字PCR 技术,
带来了前所未有的精确性和灵敏度,开启了一场核酸定量技术的革命。在未来,数字PCR
在分子诊断领域会发挥更大的作用,对于临床诊断领域分子生物标志物的筛选及验证发展会
有巨大的促进。
 

 

 
 

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